实时细胞凋亡检测-Apoptosis2018-08-01



    细胞凋亡是正常组织发育和体内平衡的一个重要过程,细胞在细胞内经历了程序性细胞死亡。细胞凋亡信号中的畸变与一系列人类病理学有关,包括癌症、自身免疫性疾病和神经退行性疾病。在大多数情况下,诱导细胞凋亡导致半胱天冬酶caspase和质膜的改变。caspase-3caspase-7的激活导致细胞凋亡的不可逆转的开启,并被认为是细胞凋亡的可靠标记。磷脂酰丝氨酸(PS)对称性的调节损失也是细胞凋亡的重要标志。死细胞会触发正常向内的PS转移到细胞表面,从而使周围吞噬细胞能够早期识别并吞噬死细胞。


许多酶标分析仪和流式细胞术都可以用来检测caspase-3/7激活或PS外翻。大多数caspase-3/7的检测包括荧光素酶,比色或荧光剂基板,它包含了一种被酶识别的DEVDAsp-Glu-Val-Asp)肽段。Annexin V是一种对PS残留物具有很高的亲和力和选择性的重组蛋白,使其能够用于检测细胞凋亡。耦合荧光探针的Annexin V的凋亡检测方法是最佳的检测PS外翻的方法,并且大多数时候运用流式细胞术分析。这些常用的凋亡检测方法最大的弊端体现在:单一的终点法检测;需要多步冲洗步骤或细胞lifting,这会导致死细胞丢失或者PS不对称性;随着时间的推移背景信号增加,它们不适合长时间监测。




IncuCyte活细胞分析系统能够在培养箱中实时自动进行细胞凋亡分析。应用Caspase-3/7Annexin V混合试剂可以同时实时检测多重细胞凋亡通路。运用IncuCyte高分辨率相差成像研究的凋亡信号,为凋亡细胞死亡提供额外的生物学视野和形态验证(如细胞收缩、膜泡、核凝结)。



IncuCyte凋亡分析试验:


  1. 加入Caspase-3/7Annexin V混合试剂实时检测细胞凋亡

  2. 应用直观的IncuCyte图像分析工具自动的定量细胞凋亡数量

  3. 通过检测细胞增殖或细胞毒性获得多重细胞凋亡数据资料


    IncuCyte凋亡分析试验的关键特点



 


自动的非侵入性的检测处理的作用无需将细胞从培养箱稳定的环境中取出,适合长时间的研究(0-10天)确定药物处理怎样和什么时候发生作用。IncuCyte细胞凋亡分析可以自动对每一个96/384板的孔进行成像和分析,提供微孔板读数图(左)。时间图揭示了浓度依赖的处理作用(中心)。将数据转换成浓度反应曲线来比较药理学(右)。

 


简单的96/384孔操作流程,无需冲洗、混合、lifting

 


通过两种凋亡数据来确认发生的细胞凋亡。同时检测Caspase-3/7Annexin V数据。自动确定凋亡细胞死亡的时间过程,并且结合无标记的confluence方法,来提供对种群内凋亡细胞比例的估计(凋亡指数)。


 

通过细胞增殖和毒性检测方法获得多重数据。量化细胞凋亡和增殖的时间过程和浓度依赖的处理作用,环己胺对HT1080细胞的影响(左),细胞凋亡细胞计数(中心),浓度反应曲线(右)。





Representative Reference


  1. Sahin, U; et al. Personalized RNA mutanome vaccines mobilize poly-specific therapeutic immunity against cancer. Nature, 547(7662):222-226, (2017)

  2. Wertz, IE; Phosphorylation and linear ubiquitin direct A20 inhibition of inflammation. Nature, 2015 Dec 17;528(7582):370-5, (2015)

  3. Wetzel-Smith, Monica K, et al. A rare mutation in UNC5C predisposes to late-onset Alzheimer's disease and increases neuronal cell death. Nature Medicine volume 20, pages 1452–1457 (2014)

  4. Ambrogio, C;etal. KRAS Dimerization Impacts MEK Inhibitor Sensitivity and Oncogenic Activity of Mutant KRAS. Volume 172, Issue 4, 8 February 2018, Pages 857-868.e15.(2018)

  5. Lu, B. et al. Identification of NUB1 as a suppressor of mutant Huntington toxicity via enhanced protein clearance. Nat. Neurosci. 16, 562–70 (2013).

  6. Alvarez-Diaz, S; et al. The Pseudokinase MLKL and the Kinase RIPK3 Have Distinct Roles in Autoimmune Disease Caused by Loss of Death-Receptor-Induced Apoptosis. Immunity, 45(3):513-526, (2016)

  7. Giampazolias, E; et al. Mitochondrial permeabilization engages NF-?B-dependent anti-tumour activity under caspasedeficiency. Nat. Cell Biol., 19(9):1116-1129, (2018)

  8. Hongyan Guo; et al. Herpes Simplex Virus Suppresses Necroptosis in Human Cells. Cell Host Microbe. 2015 Feb 11; 17(2): 243–251,(2015)

  9. Padua, RA; et al. BCL-2 Inhibition with ABT-199 Shows Efficacy in AML Cell Lines with Synergistic Effects upon Addition of the MEK Inhibitor GDC-0973 and Prolongs Survival in an NAS/BCL-2-Mediated Mouse Model of AML Post-MDS. Blood, 130(S1):2613, (2018)

  10. Renault, T. T. et al. Mitochondrial Shape Governs BAX-Induced Membrane Permeabilization and Apoptosis. Mol. Cell.(2015)

  11. Won, JK; et al. Protein disulfide isomerase inhibition synergistically enhances the efficacy of sorafenib for hepatocellular carcinoma. Hepatology, ():, (2018)

  12. Novotny, CJ; et al. Overcoming resistance to HER2 inhibitors through state-specific kinase binding. Nature Chemical Biology, 12, 923930, (2016)

  13. Kedves, AT; et al. Recurrent ubiquitin B silencing in gynecological cancers establishes dependence on ubiquitin C. J. Clin. Invest., ():, (2018)

  14. Dahlin, JL; et al. Assay interference and off-target liabilities of reported histone acetyltransferase inhibitors. Nat Commun, 8(1):1527, (2018)

  15. Grandin, M; et al. Inhibition of DNA methylation promotes breast tumor sensitivity to netrin-1 interference. EMBO Mol Med. 2016 Aug 1;8(8):863-77, (2016)