3D肿瘤球体研究(3D Spheroid)2018-07-27

癌症细胞的体外培养模型是临床前药物开发的一部分,促进了我们对癌症细胞生物学的认识。与传统的二维单层培养相比,3D细胞培养模式成为加速药物发现的先进工具应运而生。


然而,许多现有的生成和定量分析球状体的三维技术都是耗时、费力、昂贵和/或缺乏再现性的,并且阻止了具有代表性的体外肿瘤模型的有效利用。


对三维肿瘤球状体的有效分析是具有挑战性的。这些异构模型是多方面的和动态的。传统的平板阅读器分析是端点,缺乏基于图像分析的多个方面,包括形态信息和在图像中确认数据的能力。传统的成像系统受到以下因素的限制而难以适应体外培养模型的动力学分析:

不完整的数据:成像间隔期间遗漏的信息

多重不受控制的环境波动:从培养箱到成像系统的反复运输,以及在培养箱外长时间的3D图像采集制作过程,导致温度差异和缺乏对氧气、二氧化碳的控制

耗时开发最佳图像采集参数

复杂图像处理要求专业操作人员生成数量信息


IncuCyte® 3D肿瘤球体分析为在组织培养箱中实时自动监测和量化肿瘤球体的形成、生长和健康,提供了一个完整的整体解决方案。


IncuCyte® 3D肿瘤球体分析的特征:

3D肿瘤球体在培养箱中不受干扰地生长,同时可以定量无标记的生长和研究三维肿瘤球体的形态

使用非干扰试剂来研究实时生存能力的作用机制

经过实验室测试的过程,高质量的图像,和正确的分析为药理学分析提供了可靠数据

696384孔板同时自动获取、分析和绘制数以千计的图像数据,有效提高了分析速度


一.液态肿瘤球体(单个肿瘤球)分析






 

1.在培养箱中不受干扰地实时监测肿瘤球体的大小。明视野成像图片揭示了MDA-MB-231乳腺癌细胞肿瘤球体经过1 µM细胞毒性剂喜树碱的变化。对照组肿瘤球体在增大而经过喜树碱处理的球体依然紧凑,每6小时拍摄一次图片。









2.应用高质量的HD相差和DF明视野成像揭示形态学变化。接种72小时的A549MDA-MB-231细胞的肿瘤球体的高质量的HD相差和DF明视野成像图片。在图片中可以明显的区分球体的松散和紧凑形态学。通过增加2.5%matrigel胶, MDA-MB-231肿瘤球结构紧凑。所有图像以10倍的放大率拍摄。



3. 确立细胞毒素或细胞抑制的作用机制。利用细胞内的细胞化学试剂,比较明视野和荧光读数。图像显示绿色荧光是在处理后10天的SK-OV-3球状体。随时间的明视野图像显示了对这两种药物的相似反应——随着药物浓度的增加,球体的生长受到抑制。在明视野边界(下一行)测量的平均绿色强度显示了细胞毒性(喜树碱,左)和细胞抑制(环己胺,中)的不同反应。在喜树碱处理下细胞死亡,细胞毒性报告荧光强度增加,而环己酰亚胺和对照组的球体只显示了预期的细胞死亡的数量。



4. IncuCyte活细胞分析系统中持续的监测肿瘤球的生长和细胞健康状态。SKOV-3人类卵巢癌细胞稳定表达核限制荧光蛋白。随着时间的推移荧光强度被1 µM细胞毒性剂喜树碱抑制。



5. 简单易行的操作步骤。减少了对3D细胞培养技术进行故障排除的时间,并消除了使用试错方法,从而获得适合进行定量分析的稳定图像。



6. 球体生长分析显示出方便性和重复性。平板图显示三个球体类型(肺癌、纤维肉瘤、卵巢癌)在四个细胞密度上的明视野区域。明视野区域图表明,推荐2500个细胞/孔的接种密度会产生稳定的时间曲线。



7. 在生理相关的条件下进行强有力的药理学分析。在培养箱中和无标记情况下,喜树碱(CMP)、顺铂(CIS)和奥沙利柏(OXA)对SKOV-3细胞肿瘤球体作用的分析。以每个孔的5 000个细胞密度接种SKOV-3,球体72小时形成。然后用连续复合稀释法处理细胞,得到了球体生长的动力学。平板图显示了孔最大的BF区域(m2)随时间的变化。在处理后的204小时浓度曲线达到最大的BF区域(m2)。数据收集超过240小时以每6小时的间隔。每个数据点代表平均±SEM, n=8



8. 696384孔板同时自动获取、分析和绘制数以千计的图像数据,有效提高了分析速度


二. Scaffold-Based肿瘤球体(多重肿瘤球)分析




1.应用高质量的HD相差和DF明视野成像揭示形态学变化。MCF7MDA-MB-231球状体中,很容易区分圆形和星状形态。所有图像以10倍的放大率拍摄。



2. 应用动态学、多重生长和健康状态方法确立细胞毒素或细胞抑制的作用机制。A549-红色荧光染色的细胞(每孔2 K个细胞)接种在含有绿色试剂(1%)的板中,而球状体被允许形成3天。以一系列浓度CMPCHX处理球体,并设有对照组,每6小时进行一次拍摄,持续7天。处理后第4天的图片分别是明视野图像(上一行),红色荧光图像(中间行),绿色荧光(底行)。在CMP处理的球状体中,观察到整体的红色荧光强度、缺乏生长和同时增加的绿色荧光强度。尽管CHX抑制了球体的生长,但RFP的表达仍然很高,而在Annexin V中,荧光素的增加很少或根本没有增加,这表明像CHX这样的已知的细胞抑制药物引起的细胞死亡是最小的。




3.通过EC50来确认药物作用机制。细胞毒性剂CMP和细胞抑制剂CHX都引起了浓度相关的对肿瘤球体生长的抑制作用。在处理后的0-7天内使用AUCEC50显示了浓度依赖的的细胞失去活性和细胞凋亡的增加,而CHX EC50在细胞活性上几乎没有变化,细胞凋亡也没有增加。



4. 简单易行的操作步骤。减少了对3D细胞培养技术进行故障排除的时间,并消除了使用试错方法,从而获得适合进行定量分析的稳定图像。



5. IncuCyte的专利图像采集技术,用于3D培养的DF明视野成像,扩宽了图片分析的深度。




6. 在生理相关的条件下进行强有力的药理学分析。在细胞毒性化合物处理7天之前,mcf-7-红色核染色的球状体形成3天时间。时间图显示了球体大小和活性。浓度曲线代表了AUC分析的时间0-7天后的数据。所有的化合物都引起了浓度依赖对生长和活性的抑制, 依次是CMP > CHX > OXA


 



      图7. 696384孔板同时自动获取、分析和绘制数以千计的图像数据,有效提高了分析速度


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